巖藻糖基化是生物體內(nèi)一類常見的糖基化修飾，在血型決定、免疫調(diào)控、神經(jīng)發(fā)育以及腫瘤發(fā)生等生理過程中均發(fā)揮著重要作用。含巖藻糖的糖鏈結(jié)構(gòu)不僅可以作為腫瘤診斷的關(guān)鍵分子標記，也有潛力作為抗腫瘤糖疫苗藥物，或作為益生元廣泛地應用于嬰兒配方奶粉、功能性食品、食品添加劑以及保健藥品等領(lǐng)域。自然界的巖藻糖基化反應由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（Fucosyltransferases, FucTs）催化，但這類酶的催化活性通常較低，極大的限制了巖藻糖類的大規(guī)模應用。酶定向進化技術(shù)通過在實驗室中模擬自然進化的過程，可以有效改善酶的性能。由于其在酶工程領(lǐng)域的重要作用，定向進化技術(shù)于2018年獲得了諾貝爾化學獎。然而，由于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的反應難以用常規(guī)實驗方法進行高通量篩選，對這類酶的定向進化改造一直沒有取得突破。

在最近發(fā)表的《Directed evolution of an α1,3-fucosyltransferase using a single-cell ultrahigh-throughput screening method》文章中，研究團隊巧妙的利用了細胞膜表面的半乳糖透酶（LacY基因）對底物及糖基化產(chǎn)物通透性的差異，建立了可以利用流式細胞儀在單細胞層面對FucTs進行活性檢測的FACS篩選體系，速度達到每小時10⁷個克隆以上，一舉打破了這類酶的篩選瓶頸。研究團隊證明了這一系統(tǒng)可作為一種通用的篩選工具，用于α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，以及巖藻糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性等糖基化反應的定向進化中。

為驗證這一體系的有效性，他們對來源于幽門螺桿菌的α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FutA）進行了定向進化，成功獲得了目前國際報道催化效率最高的突變體，為巖藻糖苷類產(chǎn)品的生物合成提供了高效的催化劑。重要的是，他們通過解析突變酶M32的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了突變體功能改變的催化機制，發(fā)現(xiàn)突變體α2 Helix的S45突變成F45后，與周圍的芳香族氨基酸殘基W33和W34形成了獨特的“夾鉗”結(jié)構(gòu)，將受體底物牢牢的固定在底物結(jié)合口袋內(nèi)，從而使得酶與底物的親和力提高；并通過分子動力學模擬發(fā)現(xiàn)了α5 Helix鉸鏈區(qū)D127N，R128E及H131I的三個氨基酸殘基的電荷突變促進域間的相對運動變化，提出了動態(tài)鉸鏈彎曲運動引發(fā)域間運動模型，為揭示GT-B型糖基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控機制及進一步的分子改造提供了線索。

該研究建立了針對巖藻糖基化酶的單細胞超高通量篩選技術(shù)平臺，并解析了GT-B型糖基轉(zhuǎn)移酶催化調(diào)控的機制，為其它糖基轉(zhuǎn)移酶的分子改造提供了重要的工具和指導，有望促進糖生物技術(shù)領(lǐng)域的進步和重要寡糖產(chǎn)品的生物催化產(chǎn)業(yè)發(fā)展。該研究10月9日發(fā)表在Science Advances: Directed evolution of an α1,3-fucosyltransferase using a single-cell ultrahigh-throughput screening method.